در ۱۸۱۹ با شراکت سه برادرش عمدهفروشی هاپکینز و برادران را راهاندازی کرد اما ثروت عظیم او زمانی به دست آمد که بیش از هر چیز در خط آهن بالتیمور و اوهایو سرمایهگذاری کرد؛ شرکتی که وی در ۱۸۴۷ یکی از مدیرانش شد و در ۱۸۵۵ به ریاست کمیته مالی آن رسید. وی همچنین رئیس بانک تجار و نیز مدیر شماری دیگر از موسسات بود. او پس از یک دوران کاری موفق در ۱۸۴۷ و در سن ۵۲سالگی خود را بازنشسته کرد. در سال ۱۹۹۶ او در فهرست «۱۰۰ ثروتمند: از بنیامین فرانکلین تا بیل گیتس-رتبهبندی آمریکاییهای ثروتمند از گذشته تا امروز» در جایگاه شصت و نهم جای گرفت.
او در طول جنگ داخلی بر خلاف بسیاری از اهالی مریلند طرفدار اتحاد بود و ملک تابستانی وی، کلیفتون، پیوسته محل قرار طرفداران محلی اتحاد و مقامات فدرال بود. وی همچنین از حامیان آبراهام لینکلن به شمار میرفت و از وی حمایت لجستیکی و مالی میکرد. هاپکینز که به نیاز شهر بالتیمور به یک مرکز درمانی آگاه بود در سال 1870 مبالغ هنگفتی برای ساخت یک بیمارستان رایگان و کالج آموزش پرستاری و نیز یک یتیمخانه و یک دانشگاه اختصاص داد. پس از مرگش در 1873، از ارثیه وی برای ساخت یتیمخانهای به نام وی (1875)، دانشگاه جان هاپکینز (1876)، چاپخانه (1878) و بیمارستان و آموزشگاه پرستاری (1889) استفاده شد.
جان هاپکینز همچنین یک بورسیه تحصیلی برای افراد کمبضاعت مقرر داشت و تاکید کرد که در این میان نباید تبعیضی میان سفیدپوستان و رنگینپوستان صورت بگیرد. یکی از مشهورترین معماران آن روزگار با نام جان رادولف نیرنسی کار طراحی یتیمخانه را بر عهده گرفت و به طراحی بیمارستان کمک کرد.
